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华南农业大学实验报告 实验项目名称: 《兽医微生物》综合实习 所属课程名称: 《兽医微生物学》 学生姓名:杨滨 学号:200730330126 专业年级:07 动医(1)班 成绩: 一,实验目的 1.掌握营养肉汤,血琼脂平板,麦康凯平板,普通琼脂,三糖铁层琼脂的配置方法. 2.细菌的分离培养技术(解剖,病料的采集,从组织中分离细菌,培养细菌,移植细菌, 纯化细菌,细菌接种) . 3.细菌的鉴定技术(光学显微镜油镜的技术,组织涂片,在组织材料中认识细菌,辨别细 菌,生化实验,血清学实验技术及细菌片的涂片,染色,镜检等技术) . 4.病毒的鸡胚分离培养技术(鸡胚死活的鉴定,鸡胚的接种,胚液的收集)病毒的血凝试 验和血凝抑制试验. 5.认识真菌(酵母菌,青霉菌,曲霉菌,毛霉菌,根霉菌)的形态. 二,实验要求 1.通过本次综合实习全面系统地掌握兽医微生物学的基本技术和细菌检验的基本程序,掌 握各种生理生化试验的原理及试验方法,将理论与实践有机统一. 2.加强对临床常见病原菌鉴定本领的操作训练. 3.熟练掌握微生物实验常用仪器的使用及培养基制备的原则和方法. 4.对每一步实验要认真对待,对实验结果应详细记录,仔细分析,以便得出正确的鉴定结 论,实习结束后,全面总结并写出实习报告. 三,实验内容 1.细菌的分离及诊断 2.病毒的分离及诊断 3.真菌的观察 四,实验材料与设备 1.实验材料 (1) 无菌注射器,抗凝剂,健康鸡,健康兔,血琼脂基础,锥形瓶,蒸馏水,麦康凯 琼脂粉,三糖铁琼脂粉,营养琼脂粉,营养肉汤基础,雏鸡,小白鼠,木板,图钉,剪刀, 接种环,接种针,镊子,各种染色液,移液枪,葡萄糖培养管,蔗糖培养管,乳糖培养管, 甘醇培养管,靛基质培养管,硫化氢培养管,H2O2,氧化酶试纸,巴氏杆菌标准毒,巴氏 杆菌阳性血清,靛基质指示剂,载玻片,显微镜等 (2) 装有不明病毒的 80 编号小管一支,9-10 日龄鸡胚,打孔器,一次性注射器,剪 刀,记号笔,镊子,灭菌乳钵,离心管,空平皿,玻璃沙,空试管几支,西林瓶,青霉素, 移液管,锥型瓶,U 型 96 孔微量反应板,蛋架 (3)载玻片,接种环,酵母菌玻片,青霉菌玻片,曲霉菌玻片,毛霉菌玻片,根霉菌玻 片,镊子,盖玻片,显微镜 2.实验设备高压消毒炉,恒温培养箱,离心机,电子天平,冰箱,轻微振荡器 五,实验方法和步骤 实验方法和步骤 (一)细菌的的分离及诊断 1.实验前准备(此步分量为一组 6 个人) (1)心脏采血:触摸健康兔左前肢以下,胸骨以上,靠左的位置,通过心跳感觉心脏 位置, 用碘酒,酒精棉球消毒,用无菌注射器抽取 1ml 抗凝剂,并润湿注射器, 待酒精干后, 将针插入,边插边回抽,当有血冲上针筒时,即抽取血 9ml,用作血平板. (2)血琼脂平板:称取琼脂基础 3.3g,加 100ml 蒸馏水,加热溶解,倒入锥形瓶,高 压灭菌 15min,待冷却至 50℃,加入无菌脱纤维鸡兔血 10ml,摇匀,倾注至灭菌平皿. (3)麦康凯平板:称取麦康凯琼脂粉 14.3g,加 600ml 蒸馏水,加热溶解,倒入锥形瓶, 高压灭菌 15min,倾注至灭菌平皿. (实验室准备) (4)三糖铁琼脂:称取三糖铁琼脂粉 15g,加 240ml 蒸馏水,加热溶解,分装到试管, 每支约 10ml,高压灭菌 15min,趁热摆斜面,待其凝固. (实验室准备) (5)营养肉汤:称取营养肉汤基础 4.4g,加 200ml 蒸馏水,加热溶解,分装到试管,每 支约 10ml,高压灭菌 15min. (实验室准备) 2.分离培养取一因细菌感染而致死的小鼠,腹部向上固定于木板上,用酒精棉球消毒体表,打开腹 腔,暴露肝脏,用剪刀夹一燃烧酒精棉球,在肝脏表面烫之杀死表面杂菌,用灭菌接种环插 入烧灼部,将接种环旋转 1 圈,然后取材划线接种于血琼脂平板上,置 37℃温箱培养 24h. 3.形态与染色小鼠作分离培养后,用灭菌镊子和剪刀取一小块肝脏,作组织涂片,进行瑞氏染色,镜 检.观察细菌形态特征. 4.肉汤增菌培养观察血琼脂平板上的细菌菌落形态特征, 然后用灭菌接种环挑取可疑菌落, 涂抹到载玻 片上, 进行革兰氏染色, 镜检. 用灭菌接种针环挑取可疑菌落, 接种到加有血清的营养肉汤, 摇匀,置 37℃温箱培养 24h. 5.生化实验 观察肉汤变化情况,用灭菌接种环取肉汤中已纯化细菌,涂抹到载玻片上,进行革兰氏 染色,镜检.进行生化试验. (1)用灭菌接种环取肉汤中已纯化细菌,分别在麦康凯平板,营养琼脂上划线 (2)用灭菌接种针取肉汤中已纯化细菌,分别在葡萄糖培养管,蔗糖培养管,乳糖培养 管,甘醇培养管,靛基质培养管,硫化氢培养管进行穿刺 (3)用灭菌接种针取肉汤中已纯化细菌,在三糖铁琼脂上进行划线并穿刺. 将所有生化培养管及培养皿,置 37℃温箱培养 24h. 6.氧化酶和触酶试验用氧化酶试纸按压于菌落之上,若试纸变色则为阳性. 取过氧化氢滴加菌落,若产生气泡,则为阳性. 7.观察生化实验结果. 往靛基质培养管滴加指示剂,观察变化,其它生化管直接进行观察. (二)病毒的实验诊断 1.实验前准备 (1)心脏采血:触摸健康鸡左翼以下,胸骨以上,嗉囊靠左的位置,通过心跳感觉心脏 位置,用碘酒,酒精棉球消毒,用无菌注射器插入,边插边回抽,当有血冲上针筒时,即抽 取鸡血 2~3ml,装入密封管中,用于血清得制备;用无菌注射器抽取 1ml 抗凝剂,并润湿注 射器,用同样方法取鸡血 9ml,并装入离心管中,用于鸡红细胞的制取. (2)血细胞悬浮液:往无菌离心管注入 2~3ml 鸡血,再加入 4ml 生理盐水,摇匀,放入 离心机以 2000r/s 离心 10min,然后取出离心管并用无菌注射器吸去其上清液,重复 4 次. 用移液枪吸取 1ml 血细胞到 100ml 无菌玻璃瓶中,再加入 99ml 生理盐水,冷藏. 2.病毒病料的采集通过无菌手术,取病鸡的脾脏,肝脏,肺,脑的组织块,将其剪碎后,加入少量玻璃砂 研磨,然后加入 4ml 生理盐水和双抗各 0.01ml,用注射器将其注入离心管,以 10000r/s 进 行离心 10min. 3. 接种接种鸡胚,采用绒毛尿囊腔接种,通过照胚检测鸡胚死活,在气室边缘避开胚体和血管 处作一记号,作为接种的部位,碘酒,酒精消毒,并用打孔器在此处打孔;用 1ml 注射器吸 取病毒液 0.1ml,注射器沿小孔插入鸡胚约 1.5CM,注入病毒液以胶布封孔,置于 37 C 温箱中直立培养. . 4.观察已接种鸡胚 24 小时后观察鸡胚未死亡. 5.处理已接种鸡胚接种 48 小时后观察鸡胚已死,将鸡胚置 4 C 冷冻过夜. . 6.收胚收获病毒液.采用无菌手术去气室顶壳,开口直径为整个气室大小,用无菌镊子撕去 部分蛋膜, 撕破绒毛尿囊膜而不撕破羊膜, 用镊子轻轻按住胚胎, 用消毒注射器吸取尿囊液, 置于西林瓶中,备用.解剖胚胎. 7.血凝及血凝抑制试验采用 1%红细胞,以及新城疫的血清和禽流感血清,按下表操作. ①血细胞凝集试验(HA) (单位:ūl) 孔号 稀释 度 生理 盐水 病毒 鸡红 细胞 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 弃 1 1:2 50 2 1:4 50 3 1:8 50 4 1: 16 50 5 1: 32 50 6 1: 64 50 7 1 : 128 50 8 1 : 256 50 9 1 : 512 50 10 1 : 1024 50 11 1 : 2048 50 12 对照 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 用轻微震荡器震荡 1~2min, 放入 37℃箱中 15~30min.判断 1 个单位血凝价,并配成 4 个单位病毒溶液. 2 ○血细胞凝集抑制试验(HI) (单位:ūl) 孔号 稀释 度 生理 盐水 新城 疫血 清 1 1:2 50 2 1:4 50 3 1:8 50 4 1: 16 50 5 1: 32 50 6 1:64 50 7 1 : 128 50 8 1 : 256 50 9 1 : 512 50 10 1 : 1024 50 11 1 : 2048 50 12 对照 50 弃 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 4 单 位病 毒 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 用轻微震荡器震荡 1~2min,放入 37℃培养箱中 15~30min 鸡红 细胞 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 用轻微震荡器震荡 1~2min,放入 37℃培养箱中 15~30min. (三)真菌的形态观察 真菌的形态观察 直接在显微镜下观察酵母菌装片,青霉菌装片,曲霉菌装片,毛霉菌装片,根霉菌装片. 六,实验结果与分析 实验结果与分析细菌的的分离及诊断 (一) 细菌的的分离及诊断 1.瑞氏染色后,显微镜观察到蓝色,两极浓染的球杆菌 2.在血琼脂平板上培养 24 小时后,长出灰白色,湿润,有光泽,露珠状的小菌落 3.对血琼脂平板上的菌体革兰氏染色后,显微镜观察到红色,两极浓染的球杆菌 4.在营养肉汤中培养 24 小时后,原本清亮的液体变为浑浊,说明菌体在营养肉汤中大量繁 殖 5.对营养肉汤中的菌体革兰氏染色后,显微镜观察到红色,两极浓染的球杆菌,说明该菌 是革兰氏阴性菌. 6.生化试验结果: 培养 基类 型 现象 三 糖 铁 麦康 凯 葡 萄 糖 + 蔗 糖 + 乳 糖 — 甘 醇 + 靛 基 质 + 硫 化 氢 — + - 三糖铁琼脂:培养基底部变黄,说明产酸,但不产气,不产硫化氢,可能被污染 麦康凯平板:不生长 葡萄糖生化管:由原本的紫色变为黄色 蔗糖生化管:由原本的紫色变为黄色 乳糖生化管:原来的紫色变浅 甘醇生化管:由原本的紫色变为黄色 靛基质生化管:滴加指示剂后,产生玫瑰红色 硫化氢生化管:由于缺乏硫化氢指示剂,无法对硫化氢一项做出判定,该培养管并未变色. 7.氧化酶和触酶实验:氧化酶试纸变紫色,为阳性;而触酶试验产生气泡,为阳性. 以上结果与课本对照后较为接近,极有可能是巴氏杆菌. (二)病毒的实验诊断 1.24 小时后检查鸡胚未死亡,说明实验操作严格无菌操作,未感染其他细菌. 2.鸡胚收获及解剖 打开蛋壳后,提取病毒.同时接种老师提供的病毒 3.HA 试验: HA 试验结果如下表: (结果第一排为自己所收病毒液,第二排为老师所给病毒: ) 孔 号 稀 释 度 结 果 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 血细 胞对 照 # # # # # # # # # # # # # # # +++ +++ ++ ++ + + - - 结果:自己所收病毒血凝价为 1:256.老师所给病毒血凝价为 1:128. 4.HI 试验 HI 试验结果如下表: (结果第一排为自己所收病毒液,第二排为老师所给病毒) 孔 号 稀 释 度 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 病 毒 对 照 结 果 + ++ # + # ++ # # # # # # # # 血 清 对 照 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 结果:自己所收病毒的 HI 效价为 1:32.老师所给病毒的 HI 效价为 1:128. (三)真菌的形态观察 酵母菌 青霉菌 曲霉菌 根霉菌 毛霉菌 七,实验总结 1. 通过本次实验可了解并熟悉检验位置菌种的方法, 推断菌种时要综合分析 可能污染杂菌 的实验要重复进行. 病毒的接种及吸取尿囊液时, 要注意保持无菌操作, 以防带进其他细菌, 影响实验结果. 2.在实验过程中,我就被灌输了很强的意识:一进到实验室中,就要尽可能地做好一切保 护措施,这是保护自己的基本条件和要求. 3.实验中所涉及的基本实验操作,我们都要清楚了解并且知道其中的原理,这对于我们来 说尤为重要. 4.实验中必然会遇到一些自己难以理解的问题,这要求我们要与指导老师做好沟通工作, 并且要加强团队合作精神与加深自立意识,加强自我的动手能力. 5.通过本次综合实验,我们巩固了本学期所学的普通培养基制备和鲜血培养基的制备,光 学显微镜油镜的使用,细菌片的分离培养鉴定技术,病毒的鸡胚分离培养技术(鸡胚死活的 鉴定,鸡胚的接种,胚液的收集)病毒的血凝试验和血凝抑制试验方法.提高我们综合运用 兽医微生物学所学知识的能力,实际动手能力及观察,分析问题的能力.
没听说过有这个要求，河北省畜牧兽医高级技能人才培训工程