分子生物学自考真题答案解析

基因组DNA 的得率较低或者无基因组DNA 原因,如何解决?1) 样品材料老化或者反复冻融导致DNA含量下降:应选择新鲜的材料样品,如新鲜血液、新鲜菌液、刚离体的动物组织或幼嫩

的常见问题与解决方案-1 一、Southern 杂交 问题 1:电泳后发现凝胶中 DNA 扩散,导致结果难以确定,如何解决这一问 题?

简答题： 1. Please divide eukaryotic DNA into different classes according to their complexing and describe their properties.根据复杂性将真核DNA分成不同种类，并描述其特性。 答： 三种类型：1.高拷贝数，低cot值的高度重复序列。 2.单拷贝数，高cot值的非重复序列。 3.处于他们之间的中度重复序列。 特点： 1.占DNA总量10%左右，可分为三类：卫星DNA，小卫星DNA，微卫星DNA。 2.占DNA总量20%~80%，可分为可编码序列和非编码序列。 3.大多数结构基因及单拷贝序列。基因组中，单拷贝序列中储存了巨大的遗传信息，编码各种不同功能的蛋白质。 2. Please describe the processes of reverse transcription and integration of retrovirus.请描述逆转录和逆转录病毒整合的过程。 答： 逆转录分为两步，第一步是在逆转录酶作用下，以RNA为模板合成到DNA负链的过程。宿主的空载tRNA会出现在病毒颗粒中，tRNA的3’端的18bp序列能与病毒RNA分子距5’端约100~200bp的一个位点进行碱基配对。到达末端时，合成暂时停下来。5’端R区被降解，使得3’端R区与新合成的DNA碱基能够配对，然后反转录酶将整个RNA从3’端开始转录成DNA。模板转换和延伸的结果是在5’端加入一个U3序列形成第一个LTR。第二步是以DNA负链为模板合成DNA正链的过程。首先是tRNA引物被降解，然后RNA被降解，剩余的片段作DNA合成的引物。 整合到宿主DNA过程即是线性DNA到原病毒过程。主要是由整合酶所催化。 3. Please describe structs and functions of DNA Pol I and Pol II.请描述DNA聚合酶I和II的结构和功能。 答： Pol I是单亚基蛋白，由Pol A基因所编码，分子量是10万，除了具有合成DNA的能力外，还具有3’5’核酸外切酶活性和5’3’核酸外切酶活性。它的主要功能是DNA修复和在DNA复制过程中将RNA引物切除。 Pol II具有DNA聚合酶活性和3’5’核酸外切酶活性，但不具有5’3’核酸外切酶活性。主要功能是DNA修复。 4. Please describe DNA replication initiation in prokaryotic.请描述原核生物中DNA复制的启动。 答： 首先是DnaA蛋白去寻找复制起始位点，它能够识别并结合在OriC的9bp重复序列上，一旦这四个重复序列被占满了，20多个额外的DnaA就会以协同作用的方式与OriC结合形成initial complex。接着DnaA使得起始位点左侧的3个富含AT的重复序列的两条链解开，形成open complex。这是在DnaC的帮助下，DnaB以六聚体的形式结合到这个open起始位点上，形成pre-priming complex，DnaB是解旋酶，它能够在Gyrase的帮助下，将DNA双链进一步解开，所形成的DNA单恋迅速被SSB四聚体结合，防止DNA链重新结合。然后，在其他蛋白的帮助下，具有产生RNA引物功能的引物酶也结合上去，形成引发体primosome，然后以DNA为模板，分别在先导链和滞后链上合成出RNA引物出来。一旦引物合成出来，引物酶就脱落下来，等待下一次的结合。然后DNA聚合酶III结合到复制叉上，将第一个dNTP接到RNA引物的3-OH上，起始过程就结束了。 5. Please describe roles mechanism and process of mismatch repair.请描述错配修复的作用，机制和过程。 答： DNA复制保持低错误率的一个方面是来自于错配修复。错配修复是依靠甲基化状态的不同，对DNA复制后的亲代和子代DNA链进行区分，然后以母链为模板，对子链中错配的碱基进行更正的修复系统。 在DNA甲基化前，修复系统对DNA进行巡查，当错配的碱基被识别时，相应的酶总是从非甲基化链去除和置换核苷酸，确保恢复最初的碱基对。错配修复机制检查无误后，新和成的子链也被甲基化，就如贴上一个合格标签一样。 6. Please describe mechanism process and consequence of transcnl 7. Features of introns in eukaryotic pre-tRNA and pre-rRNA，how to remove them？真核前体tRNA和前体rRNA中内含子的特点，怎样移除他们？ 答：前体rRNA属于I型自我剪接内含子，可以在没有酶的催化条件下，自行进行RNA剪接，从RNA前体上将自己切除，它是通过两步转酯反应将自身切除。第一步中鸟嘌呤核苷酸作为辅因子提供一个游离的3’-羟基连于内含子的5’端，第二步中外显子A的3-OH攻击外显子B的5端，从而释放出内含子，将两个外显子连接在一起。 真核tRNA前体中内含子是单独成为一种内含子类型的，以酵母为例，内含子中都有一段与tRNA反密码子互补的序列，位于反密码子的3下游区，内含子没有保守序列，切除内含子的酶与tRNA前体分子的结合，依靠的是对tRNA前体分子的二级结构特征的识别，而不是对内含子一级序列特征的识别。切除内含子的过程首先是底物的识别和切割，不需要能量，由一个特殊的核酸内切酶对tRNA前体中的内含子的两端进行切割，将内含子切除。然后是连接反应，在酵母和植物中，环状磷基团在环化磷酸三酯酶的作用下打开，形成的产物具有2’-磷酸基团和3’羟基，最后在ATP存在下，连接酶将两个tRNA半分子连接在一起。对于哺乳动物，连接酶可将RNA的2’，3’-环磷酸基直接与5’-羟基末端相连，形成正常的5‘3’磷酸二酯键，而不是产生额外的2磷酸基团。 8. Features of introns in eukaryotic pre-mRNA and how to remove them？真核前体mRNA中内含子的特点，怎样移除他们？ 答： mRNA前体中的内含子绝大多数是GU-AG形式的内含子，它们只靠自身序列是不能进行RNA剪接的，他是在剪接体的催化帮助下完成RNA剪接过程的。在他的5剪接位点含有保守的GU序列，在他的3剪接位点含有保守的AG序列。切除内含子的过程分三部分，第一阶段是内含子的5’端切开，形成游离的左侧外显子和右侧的内含子-外显子分子，形成套索结构。第二阶段是3端剪接位点被切断然后以套索形式释放。第三阶段是右侧的外显子和左侧的外显子连接在一起。 9. Roles of subunits of prokaryotic RNA pol?原核RNA聚合酶亚基的作用？ 答： α亚基是装备核心酶所必须的，在启动子识别中起到一定的作用。还在RNA聚合酶与其他调控因子的相互作用中发挥作用。 β’亚基是RNA聚合酶中最多的亚基，它的功能是与DNA相结合。 β亚基的功能则与NTP结合，并具有催化聚合反应的活性。β’和β共同形成RNA合成的活性中心。 σ因子可以识别启动子。 ω亚基的功能是促进RNA聚合酶的组装。 10. Roles of CTP of RNA pol II in RNA transcription and processing?RNA聚合酶II CTD在RNA转录和加工的作用 答： CTD是RNA聚合酶2最大的亚基的羧基末端结合域。它由52个重复七肽组成，CTD的磷酸化与转录延长阶段的开始有关，聚合酶的磷酸化促使酶与GTF和启动子分开，是酶脱离前起始复合体而沿DNA模板移动。CTD还能作为一个平台，与许多与RNA加工相关的蛋白相结合。 11. Transcription termination of eukaryotic mRMA and Generation of 3'poly(A) tail?真核mRNA的转录终止和3’末端polyA的形成过程 答： 真核mRNA转录终止有两种模型，第一种是变构模型，磷酸化的CTD能够结合与RNA切割和多聚腺苷化有关的蛋白因子，这些蛋白因子可以识别转录出来的RNA上的加载多聚腺苷酸的信号，由核酸内切酶对RNA进行切割，之后他们都从RNA聚合酶复合体上脱落下来，这样就改变了RNAP的构象，减弱了持续合成RNA的能力，转录自然停止。第二种模型是鱼雷模型，CTD结合有催化5端帽子生成的鸟苷酸转移酶，可以为刚合成出来的RNA加上5帽子结构，此结构能为核酸外切酶所识别，核酸外切酶不断从5端向3端进行消化，直至追赶上RNA聚合酶，使得RNA聚合酶从DNA模板上脱落下来，转录停止。 Poly（A）聚合酶能够不断将ATP加载到RNA的3端，生成poly（A）尾巴。位于末端的A正好能够作为poly(A)的模板。 12. Transcription initiation of eukaryotic RNA pol I II III? 真核RNA聚合酶I II III 的转录起始 答： Pol II: 起始子和TATABOX构成了核心启动子，它是转录起始的充要条件，但其转录效率比较低，需要激活蛋白的参与，少数没有TATBOX的启动子，其核心启动子是由启动子和DPE元件构成。核心启动子的上游是两个调节元件，CAATBOX和GCBOX。转录起始需要GTF参与，它是通用转录因子，TBP能够识别和结合TATABOX，TAF是TBP的连接因子，TBP的TF2D和TATABOX结合，TF2A通过稳定D和TATABOX之间的相互作用，对转录过程有刺激作用。TF2E和TF2H结合，生成前起始复合体。TF2H将CTD磷酸化，转录开始。 Pol I： 只转录rRNA基因，启动子由核心启动子和上游的UCE组成。核心结合因子主要负责确保RNA聚合酶正确定位在起始点上，辅助因子UBF提高转录频率，是核心结合因子能够与核心启动子更有效的结合。 Pol III： 根据启动子位置不同，分为内部启动子和上游启动子，内部启动子分为type1和type2两种启动子，他们都需要TF3ABC的参与。 Type1： 首先TF3A和BOXA结合，导致TF3C与BOXC结合，然后TF3B结合到起始点上，进而聚合酶结合上来。 Type2： 和type1不同的一点是，TF3C同时结合到盒A，B上，这样TF3B结合到起始点上，聚合酶结合上来。 Type3： 首先snRNA激活蛋白复合物SNAPc与PSE结合，然后SNAPc可以帮助TF3B结合到TATABOX上，最后在TF3B的帮助下，RANP3与转录起始点相结合。 13. Transcription termination in prokaryotic原核生物的转录终止 答： 转录终止分为Rho因子依赖型和非依赖型。 非依赖型：首先当RNA聚合酶将两个富含GC的反向重复序列转录出来后，进入到寡居U合成区；由于这两个富含GC的序列互补，所以这两段序列和中间的非重复序列就形成一个颈环结构；这个颈环结构或者说是发卡结构的形成，会使RNA聚合酶放慢RNA的合成速度，或是干脆暂停RNA的合成，使得RNA聚合酶停留在polyU合成区中。此时，RNA-DNA杂交链就会在终止区中，弱的rU:dA碱基配对处解开，RNA链从DNA模板链上脱落下来，转录就终止了。 依赖型：首先是RNA聚合酶进行转录，然后Rho因子与转录出来的RNA上的rut site识别和结合。然后利用ATP水解作为动力沿着RNA追赶RNA聚合酶。当RNA结合酶遇到终止子而暂停下来时，Rho就有可能追赶上RNA聚合酶。Rhp因子将转录泡内的RNA-DNA杂交链解链，在解链过程中，可能还有Rho和RNA聚合酶之间的相互作用的参与。然后转录就停止了。 14. Conserved features of bacterial promoter细菌启动子的保守特征 15. Fidelity of AA-tRNA syn thesis